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微流控芯片技术及其在生物医学中的应用

2018-08-28 06:36 | 来源:未知 | 责任编辑:本站编辑

作者:佚名   


引言


生化反应芯片的功能就是把在普通实验室中进行的生化反应实验缩微到一块小小的芯片上来完成。目前报道的生化反应芯片主要包括聚合酶链反应(Polymerize Chain Reaction,PCR)芯片、药物合成芯片等,其中 PCR 芯片是生化反应芯片的典型代表。众所周知,常规 PCR 需要制样、扩增及检测等步骤,既费时又费力,而当用微流控芯片进行 PCR 扩增及相关检测时,则可大大简化操作步骤、显着提高检测效率。为了进一步提高 PCR 芯片的热循环速度,Kopp M U 等人发展了一种连续流动式的 PCR 芯片,流动式芯片下面有 95℃、72℃、60℃ 三个不同的恒温区间,当样品流经它们时就会实现自动变温,在流动中完成变性、退火和延伸反应,达到 PCR 扩增的目的。


微流控芯片发展历史


微流控芯片(Microfluidic Chip)是指通过微电子机械系统(Micro-electro-mechanical Systems,MEMS)技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析单元和系统,以实现对无机离子、有机物质、蛋白质、核酸以及其他生化组分的准确、快速和大信息量的检测。它是最近十几年来在微电子技术、生物技术、化学技术等多学科交叉的基础上发展起来的一种新型生化检测技术。实质上讲,微流控芯片就是一种微型化了的生化分析仪器,微流控芯片发展的最终目标是实现生化样品的微全分析,即把样品处理、生化反应和结果检测等三个典型的步骤全部集成在微芯片上完成。它已经广泛应用于生物医学、高通量药物合成筛选、食品卫生和环境监测等诸多领域。由于它具有成本低、高通量、分析过程自动化、分析速度快、试剂消耗少、易于集成化等优点,目前已经成为分析学科领域最活跃的发展前沿,代表着未来分析仪器走向微型化、集成化的发展方向。


广泛来说,当前生物芯片主要分为微阵列芯片和微流控芯片两种类型,前者是以静态亲和杂交技术为基础,主要有基因芯片、蛋白质芯片等形式,目前已经深度产业化;后者是以微流体控制技术为基础,主要有毛细管电泳芯片、PCR 反应芯片等形式,开始由应用基础研究向产业化过渡,所以无论是在技术领域还是在商业领域,其竞争都已经趋于白热化。由于微流控芯片是以微全分析为主要目标,所以它表现出了更为诱人的应用前景。微流控芯片实验室的早期形式是芯片毛细管电泳,直到如今,毛细管电泳芯片仍是微流控芯片中分离部分的主体和研究热点,并且也是微流控芯片领域中最先实现商品化的一类芯片。


微流控芯片研究中的相关技术


1. 微流控芯片的基质材料


基质材料是微流控芯片的载体,在微流控芯片发展的初期,硅材料作为构建微流控芯片的首选材料而被广泛使用,这主要归因于业已成熟的半导体技术。但是随着研究的不断深入和应用领域的不断拓展,它表现出了不同程度的局限性:硅材料属于半导体,不能承受高电压,此外,硅材料不透明,与光学检测技术不兼容。玻璃材料具有很好的电渗性质和优良的光学性质,无论是从其物理性质还是化学性质来讲,都非常适合于微流控芯片的制作,但是它的光刻和蚀刻技术工艺复杂、费时,制作成本过高,这些因素制约了玻璃微流控芯片的应用和推广。因此,研究者们开始把更多的注意力转向了原材料便宜、加工制作简单的高分子聚合物,目前,以聚二甲基硅氧烷(PolydiMethyl-Siloxane,PDMS)为代表的有机高分子聚合物已成为微流控芯片研究的热点,PDMS 表现出了非常理想的材料特性:良好的绝缘性,能承受高电压,已广泛应用于各种毛细管电泳微芯片的制作;热稳定性高,适合加工各种生化反应芯片;具有很高的生物兼容性和气体通透性,可以用于细胞培养;同时具有优良的光学特性,可应用于多种光学检测系统;弹性模量低,适合于制作微流体控制器件,如泵膜等。此外,PDMS 还可以和硅、氮化硅、氧化硅、玻璃等许多材料形成很好的密封。此外,较常用的高分子聚合物还包括聚甲基丙烯酸甲酯(PolyMethylMethAcrylate,PMMA)、聚碳酸酯(PolyCarbonate,PC)等。


2. 微流控芯片的加工技术


微细加工技术是微流控芯片发展的前提条件,微流控芯片的制作技术首先起源于制造半导体及集成电路芯片所广泛采用的光刻(Lithography)和蚀刻技术(Etching),目前已经广泛地用于硅片、玻璃和石英等基质材料上微流体网络的制作。其微制造工艺为:首先通过光学制板照相技术制备包括微流控芯片图案的掩模,制备好的掩模通常是镀有铬层的石英玻璃板;然后用甩胶机均匀地在芯片表面涂敷一层光刻胶,在紫外光下进行曝光,显影。上述工作完成之后,用相应的腐蚀剂对芯片进行蚀刻,蚀刻完成后,去除剩余的光刻胶便可获得所需的芯片微细结构。该方法工艺周期长、制作成本高,但其微加工技术非常成熟。


与硅片、玻璃材料不同的是,可用于微流控芯片加工制作的高分子聚合物种类繁多,而且各材料之间的物理化学性质差别很大,所以它们的微加工技术表现出了一定的多样性,目前主要有模塑法、热压法、LIGA 技术、激光烧蚀技术和软光刻法等。模塑法(Injection Molding)是指通过光刻掩模技术制得凸起的微流控芯片阳模,然后在阳模上浇注液态的高分子聚合物,当高分子聚合物完全固化后将其与阳模剥离即可得到具有微流体网络的基片,适宜采用模塑法的高分子材料应该具有很低的黏度和很低的固化温度,如 PDMS,环氧树脂,聚四氟乙烯等材料。热压法也是一种需要阳模的微流控芯片制造技术,该技术主要利用了高分子聚合物的玻璃转化温度。与模塑法相比,热压法制得的微通道重复性较差,而且管道易产生变形,操作条件相对苛刻。该方法主要应用于热塑性材料的加工,如 PMMA 和 PC 等。激光烧蚀(Laser Ablation)是一种新型的微细加工技术,它是通过紫外激光降解高分子聚合物,适宜激光烧蚀加工的材料有 PMMA、聚苯乙烯、硝化纤维等。


3. 微流控芯片的微流体控制技术


微流体操纵技术是微流控芯片技术中最重要的一个研究领域之一,通过各种机械或非机械力实现对流体的驱动和控制。依据微流体驱动体系中有无机械活动部件,可以将其分为机械和非机械驱动系统,机械驱动系统主要包括压电微泵、静电微泵等,它主要是通过静电、压电等不同方法来触发引起的机械部件的运动,从而为微流体提供动力源,这种泵的优点是任何流体都可以推动,但其所驱动的流体呈脉冲状而不是连续式的。非机械驱动系统主要包括电渗泵、热毛细管泵等,其中电渗泵是微流控芯片系统中最常用的一种驱动力,相对于微机械压力驱动的泵来说,电渗泵有很多优点:如电渗泵易于制作而且没有任何移动部件,电渗泵的样品柱只有少量的扩散,此外,可以采用改变微通道壁 x(电势)的方法来进一步控制电渗流的量和方向。


4. 微流控芯片检测技术


微流控芯片的结构特征决定了其检测技术的特殊性,与传统检测仪器相比,微流控芯片对其检测系统提出了更高的要求,如要求灵敏度高、响应速度快、具有平行分析功能和便携式特征等,目前基于不同原理的很多检测技术都已经应用到微流控芯片的研究中,主要有光学检测、电化学检测、质谱等方法


(1)光学检测


光学检测是微流控芯片检测方法中应用最广的一种,其优点在于灵敏度高、实用性强,且检测器与分析对象不需直接接触。其中激光诱导荧光检测(Laser Induced Fluorescence,LIF)是目前最灵敏的检测方法之一,其灵敏度达到 10-9 mol/L~10-12 mol/L,对于某些荧光效率高的分子,其检测能力可以达到单分子水平,因此它也是当前商品化微流控系统中唯一被采用的检测器。但该检测设备价格昂贵,而且体积庞大,与微尺寸的微流控芯片极不匹配,一定程度上限制了其广泛推广与应用。


(2)电化学检测


基于电化学检测原理的检测系统可以说是最完整的、最集成、最理想的芯片检测系统之一,这主要有两方面的原因:一方面,微电极的制造技术与当前微流控芯片的加工工艺是完全兼容的,可以实现大批量生产;另一方面,电化学检测具有灵敏度高、选择性好、不受光程和样品浑浊度影响等优点,且只需要极少的外围辅助设备即可实现快速检测。无疑,基于电化学原理的芯片检测技术代表未来芯片检测器的一个重要发展方向,显示了巨大的应用价值和潜力。


(3)质谱检测


质谱检测技术作为生物化学分析的重要手段,由于能够提供试样组分中生物大分子的基本结构和定量信息,所以在微流控芯片检测器中表现出了巨大潜力,但当前质谱检测的瓶颈在于质谱仪与微流控芯片的接口问题。


微流控芯片在生物医学领域中的一些应用


从微流控芯片的分析性能看,其未来的应用领域将十分广泛,并且其应用领域仍在不断地拓展之中,但目前的重点显然是在生物医学领域。除此之外,高通量药物合成与筛选、环境监测、食品卫生、刑事科学及国防等方面也会成为重要的应用领域。现仅就微流控芯片在生物医学领域的应用举三个例子说明微流控芯片系统的巨大潜力:


1. 毛细管电泳分离


毛细管电泳芯片是微流控芯片中发展最早、也是发展最快的一项芯片技术,目前已经成为微流控芯片领域中最令人瞩目的一个分支,与传统的毛细管电泳相比,它具有自动化程度高、样品消耗少、分析速度快以及高通量等特征,在对DNA片段、多肽、蛋白质等生物大分子的分析中,它表现出了超强的分离分析能力,它被认为是后基因时代中最有希望攻克蛋白质研究、基因临床诊断等科学难题的分离分析手段之一。


为了进一步提高芯片的分析能力,Mathies 领导的研究小组最近在直径为 200 mm 的圆盘玻璃芯片上集成 384 个毛细管电泳微通道,其有效分离长度达到了 8 cm,对 100 bp(base pair,碱基对)~1000 bp 的基因标准标记物达到了优于10 bp 的分辨率,并在该芯片上完成了 1163 D 变异基因的 PCR-RFLP(限制性片断长度多态性)分析,为临床诊断提供了依据。我们实验室研制出了一种新型结构的 PDMS 电泳微芯片,并已经在自行研制的 LIF 检测系统上完成了对氨基酸、PCR markers(标记物)的电泳分离,临床应用实验也正在进行之中。


2. 基因测序


毛细管电泳的一个重要应用领域是基因测序,正是因为 96 根毛细管电泳阵列仪广泛地应用于人类基因组计划的测序工作之中,才使举世瞩目的人类基因组计划的进程大大加快,使之由原定的 2003 年提前到 2000 年基本完成。事实上,从基因测序的原理来讲,芯片毛细管电泳测序和普通毛细管电泳测序是完全一致的,但前者表现出了更大的优越性:首先由于芯片毛细管电泳独特的注样方式和更细的分离通道,所以它能实现 DNA 的快速分离;另一方面微流控芯片采用了半导体工业中成熟的微加工技术进行制造,所以一块芯片上可以集成更多的毛细管,实现高通量测序;最后由于它实现了产物处理和分析的集成化,减少了人为干扰,因此更进一步地降低了操作成本。


Mathies 领导的研究小组早在 1995 年就开始在微流控芯片上开展了 DNA 测序工作,他们在一块有效分离长度为 3.5 cm 的芯片上测序了 150 个碱基,他们利用芯片变性毛细管电泳在 10 min 之内就完成了对 433 个碱基序列的测定。该测序芯片的毛细管长度为 3.5 cm,横切面尺寸 50 μm×8 μm。为了进一步提高 DNA 测序能力,到 2001 年他们在直径为 150 mm 的圆形玻璃芯片上,刻蚀出了 96 个呈辐射型排布的毛细管电泳通道阵列,由于芯片采用旋转扫描 LIF 法进行检测,所以可实现平行测序,测序达 500 碱基。


3. PCR 反应


微流控芯片目前已经成为生物医学领域研究的前沿和热点,因为它从根本上改变了传统生化分析的方式和效率,它将具有广阔的应用前景和极富潜力的应用价值。随着微流控芯片制作技术的不断成熟和各种新型材料的不断开发,微流控芯片的功能将更为完备、集成化程度将更高。以微流控芯片为核心的微全分析系统将使化学分析进入病房、生产现场甚至家庭,可以预见,在不久的将来一种随身携带用于监测人体健康状况的“掌上型实验室”将开发出来,通过无线通信技术,甚至可以实现远程诊断。总之作为一种高度集成化、微型化以及智能化的生化分析仪器,微流控芯片将对人类的生活产生极其广泛、深远的影响,甚至可能会给生命科学领域和生化分析领域带来一场革命。


另外,一旦把 PCR 芯片与毛细管电泳芯片二者集成起来的时候,其优势就显得更为明显。Lagally E T 等人在玻璃芯片上制作了集阀门、疏水孔、PCR 反应池以及毛细管电泳(CE)于一体的芯片系统,PCR 反应池体积是 280 nL,PCR 扩增前所需模板浓度为 20 拷贝/mL,反应室中平均仅为 5~6 个 DNA 模板分子,加热器和热电偶集成在芯片的背面,10 min 即可完成 20 个循环。反应完成后,PCR 反应产物在电渗泵的驱动下进入毛细管电泳芯片中,进行在线 CE 分离分析。该芯片系统集取样、PCR 扩增和 CE 分离于一体,节省了试剂消耗、加快了分析速度,同时也避免了实验操作中的人为污染。


结论与展望


微流控芯片目前已经成为生物医学领域研究的前沿和热点,因为它从根本上改变了传统生化分析的方式和效率,它将具有广阔的应用前景和极富潜力的应用价值。随着微流控芯片制作技术的不断成熟和各种新型材料的不断开发,微流控芯片的功能将更为完备、集成化程度将更高。以微流控芯片为核心的微全分析系统将使化学分析进入病房、生产现场甚至家庭,可以预见,在不久的将来一种随身携带用于监测人体健康状况的“掌上型实验室”将开发出来,通过无线通信技术,甚至可以实现远程诊断。总之作为一种高度集成化、微型化以及智能化的生化分析仪器,微流控芯片将对人类的生活产生极其广泛、深远的影响,甚至可能会给生命科学领域和生化分析领域带来一场革命。


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